作者:褚现明(医院)王妮(青医院东区)孙雪霞(青医院东区心内科)李冰(青岛大学医学院)安毅(青岛大学医医院)徐庆科(医院)
氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL)是诱导动脉血管内皮细胞凋亡的重要因素[3],内皮细胞保护是动脉粥样硬化防治的关键环节[1-3]。研究提示天然海洋药物———螺旋藻藻蓝蛋白(C-Phycocyanin,C-PC)具有独特的抗动脉粥样硬化疗效[4-5],因此本研究旨在构建血管内皮细胞损伤模型,探讨C-PC在血管内皮细胞脂质过氧化损伤中所起的保护作用。
1材料与方法
1.1 实验材料 藻蓝蛋白由本课题组提取纯化(纯度为Anm/Anm=4．71)[6];♂Wista小鼠(g,4周龄)。LDL购自美国Chemicon公司。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、SOD检测试剂盒、N0检测试剂盒、MDA检测试剂盒、ET放射免疫药盒(Sigma)。型CO2孵箱(Forma);高速低温冷冻离心机3K30型(美国PE);紫外分光光度计(日本岛津)。VIDAS计算机图像分析系统,OLYMPUS倒置相差显微镜。
1.2 原代小鼠血管内皮细胞的培养 取小鼠胸主动脉,植块法在含20％胎牛血清的DMEM培养液中培养。倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特征,免疫细胞化学方法进行血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原(vonWillebrandfactor,vWF)鉴定。试验用2-4代细胞,细胞均处于对数生长期。
1.3 实验分组和药物干预 甲基四唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性、筛选药物剂量,选取低于10％的内皮细胞生长受抑制(IC10)的C-PC浓度进行药物干预。分组:正常对照组、ox-LDL组、ox-LDL+C-PC组。对数生长期的内皮细胞(2×L-1),接种于96孔板中,每孔μl。各组于37℃5％CO2孵箱内培养12h。然后ox-LDL组、C-PC组用含有ox-LDL的培养液继续培养,24h后进行检测。
1.4 ox-LDL诱导动脉内皮细胞脂质过氧化损伤和凋亡LDL氧化修饰和鉴定[7],获取ox-LDL用于诱导培养内皮细胞凋亡,25％的细胞生长受抑制所需要的ox-LDL浓度,约为20mgL-1。
1.5 单核细胞(HL60)黏附计数法测定内皮细胞黏附性96孔板,内皮细胞接种并培养至融合,不同浓度的C-PC预孵12h,然后加入终浓度为0.1gL-1的ox-LDL继续培养24h,倾去培养液。每孔加入L-1的HL60细胞,37℃,2h后洗去未黏附细胞,观察并计算各组HL60黏附内皮细胞数。
1.6 ox-LDL诱导内皮细胞脂质过氧化损伤的指标测定 分别采用*嘌呤氧化酶法、亚硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸法、放射免疫法,测定细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)活性、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量、内皮素(ET)含量。
1.7 统计学分析 用SPSS17.0进行t检验、方差分析,数据以x±s表示。
2结果
2.1 ox-LDL诱导动脉内皮细胞凋亡 低于细胞生长抑制率≤10％(IC10)的C-PC药物浓度:C-PC＜80μmolL-1。选取药物干预浓度20、40、60、80μmolL-1。
正常内皮细胞为扁平多角形,细胞间连接致密,呈连续排列的单层,核圆形或椭圆形、清晰,核仁1~2个。ox-LDL损伤后,细胞收缩变圆,细胞间隙明显增宽,部分细胞脱落。ox-LDL+C-PC干预组形态异常和脱落细胞减少,最佳C-PC干预浓度为80μmolL-1。
2.2 C-PC对培养的内皮细胞黏附性的影响(Tab1)ox-LDL+C-PC组黏附的HL60细胞数均较ox-LDL组减少,80μmolL-1C-PC组的黏附数仅为ox-LDL组的59.4％(P＜0.01)。
2.3 各组SOD活性、NO、MDA及ET含量的变化(Tab2) ox-LDL组与正常对照组比较,细胞培养液中SOD活性、NO含量明显降低、MDA、ET含量明显升高。ox-LDL+C-PC组80μmolL-1与ox-LDL组相比,SOD活性、NO含量分别增加％和％,MDA、ET含量分别下降49％和74％。线性相关分析显示SOD活性、NO含量与C-PC呈剂量正相关(r=0.97,0.96,P＜0.01);MDA、ET含量与C-PC呈剂量负相关(r=-0.,-0.,P＜0.05)。
3讨论
螺旋藻富含藻蓝蛋白(C-PC),含量达60~70％。分离纯化的C-PC具有水溶性、安全、无*的特点[6],研究表明,CPC具有调节血脂、抑制血管损伤后的平滑肌细胞的过度增殖、抗肿瘤增殖的作用[5,8]。
ox-LDL是内皮细胞损伤的关键因素之一,促进内皮细胞及单核细胞分泌黏附分子,使单核细胞易于黏附。内皮细胞所具有的抗氧化机制如SOD可清除活性氧,SOD活性降低,氧自由基生成增加,氧化细胞膜双层磷脂结构中的重要脂类,生成多种脂质过氧化物,使得培养液中MDA含量增高,MDA为脂质过氧化反应的中间产物,常被作为观察活性氧生成和膜损害的指标[9]。NO和ET的动态平衡,最终决定了血管的舒缩和平滑肌细胞的有丝分裂状态。缺氧可使内皮细胞合成NO,而ETmRNA表达的增加;SOD可减轻ET对鼠骨骼肌缺血/再灌注损伤的加剧[9]。
本研究结果提示,C-PC抑制ox-LDL诱导内皮细胞脂质过氧化损伤,可能的机制:(1)提高SOD活性,减少活性氧生成,MDA生成减少;(2)使NO产生增多、减少ET生成,有助于改善血管舒张功能;(3)抑制脂质过氧化损伤,抑制单核细胞的黏附。但深入的机制研究有待明确,如可能与减低NO的氧化失活、激活eNOS、提高NO生物利用度、影响ETmRNA水平及转录有关,这还有待于进一步的深入研究。
参考文献（略）
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