孙海彬 赵小晴 朱敬丽 高伟
__哈尔滨医院麻醉科
国际麻醉学与复苏杂志,,40(12):-.
DOI：10./cma.j.issn.-..12.
基金项目
中国博士后基金特别资助项目（T）
_____ORIGINALARTICLES
__虽然手术操作、药物研发和器官保护等技术不断进步，但肺移植患者5年生存率仍远低于其他器官移植患者，术后急性排斥反应是患者主要死亡原因之一。研究发现，约55％的肺移植患者发生急性排斥反应。
研究发现，受损的血管内皮细胞与T细胞的接触是急性排斥反应的关键，而内皮祖细胞（EPC）是干细胞的一种亚型，可以通过旁分泌或直接分化方式修复受损的血管内皮细胞；另外，本研究组前期研究还发现EPC可以通过内皮型一氧化氮合酶途径减轻肺移植后缺血/再灌注损伤。因此，理论上EPC可以减轻移植排斥反应和炎症反应。考虑到血管内皮细胞在排斥反应的关键作用以及EPC对血管内皮细胞的修复作用，本研究建立了肺移植排斥反应模型，探讨EPC对急性排斥反应损伤的作用及其机制。
1 材料和方法
_1.1 实验动物、试剂和仪器
供体为健康清洁级SD大鼠（g左右）16只，受体为健康清洁级Wistar大鼠（g左右）24只。
主要试剂：Histopaque、EGM-2、戊巴比妥钠。主要仪器：生物安全柜、倒置相差显微镜、二氧化碳培养箱、离心机、动物监护仪、小动物呼吸机。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组
24只Wistar大鼠按随机数字表法分成假手术组（S组）、对照组（C组）和EPC组，每组8只。大鼠给予3%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔内注射麻醉，S组大鼠仅接受开胸手术，C组和EPC组大鼠接受肺移植手术。
1.2.2 EPC培养
抽取Wistar大鼠外周血，密度-梯度离心后分离单核细胞。培养10d后获取贴壁细胞用于分析或移植。通过红色荧光标记乙酰化低密度脂蛋白（DiI-ac-LDL）、绿色荧光标记荆豆凝集素（FITC-UEA-1）以及血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）、CD34鉴定EPC。EPC具体培养及鉴定方法参考本研究组前期研究结果。
1.2.3 肺移植及分组处理
供、受体大鼠分别给予3%戊巴比妥钠腹腔注射（30mg/kg）麻醉后，行气管插管机械通气。机械通气参数设置：潮气量10ml/kg，呼吸频率50次/min，FiO%，吸呼比1∶1。供体肝素化后于左侧第4、5肋间开胸，打开胸腔后，分别剪开左右心耳后经右心室置管（16G），以20cmH2O压力灌入4℃生理盐水（60ml/kg，4min）以冲洗肺内残留血液，然后在肺部中度膨胀时夹闭气管，在显微镜下分别游离出左肺门部的动静脉及支气管，剪断后套上CUFF管，移植物储存在4℃生理盐水中；随后受体于左侧第4、5肋间开胸，充分暴露胸腔后，在显微镜下分别游离出左肺门部的动静脉及支气管后用止血夹钳闭近心端，结扎远心端，用CUFF管分别连接至供体肺的动脉、静脉和支气管，CUFF管紧固后，释放夹子，血运恢复，经充分鼓肺后关闭胸腔。再灌注后，C组、EPC组分别静脉给予PBS溶液1ml、EPC+PBS溶液1ml（EPC约1×个细胞溶于1mlPBS中）。关胸，待受体恢复自主呼吸后拔管，在无菌条件下饲养7d。期间无其他额外免疫抑制治疗。手术过程中大鼠体温维持于36~37℃。术后第7天进行指标测定。
1.3 测定指标
3组大鼠在术后第7天，首先抽取股动脉血，一部分进行血气分析测量氧合指数（PaO2/FiO2），另一部分用来制备血清，用ELISA法测量血清炎症因子淋巴细胞功能相关分子（LFA-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）浓度，通过这些指标间接反映肺移植排斥反应。随后放血处死动物，取部分移植肺测量肺组织湿/干重比以反映肺水肿的程度；部分肺组织用于制备组织匀浆（1∶9），用ELISA法测量移植肺炎症因子γ-干扰素（IFN-γ）、IL-2、IL-10浓度，以反映肺移植后炎症细胞的浸润情况；部分移植肺组织通过H-E染色评估排斥反应。
2 结 果
_2.1 EPC的鉴定
单核细胞培育10d后，通过荧光显微镜鉴定是否为EPC。首先通过细胞“鹅卵石”或“纺锤形”外形判断。其次，通过观察单核细胞是否表达VEGFR2、CD34及FITC-UEA-1、DiI-ac-LDL来判断。结果显示，收集的单核细胞为EPC（图1）。
2.2 EPC对肺毛细血管通透性的影响
肺移植7d后，C组和EPC组PaO2/FiO2低于S组（P＜0.05），C组和EPC组肺组织湿/干重比和外周血中LFA-1和ICAM-1高于S组（P＜0.05，表1）；与C组比较，EPC组的PaO2/FiO2升高（P＜0.05，表1），EPC组外周血中LFA-1和ICAM-1降低（P＜0.05，表1），肺组织湿/干重比降低（P＜0.05，表2）。
2.3 EPC对肺移植后炎症反应的影响
与S组比较，C组和EPC组肺组织匀浆中IFN-γ、IL-2和IL-10均升高（P0.05）；与C组比较，EPC组肺组织中IFN-γ、IL-2降低，而IL-10升高（P0.05，表2）。
2.4 EPC对排斥反应的影响
肺移植7d后，S组肺组织结构正常，肺泡结构完整，管腔及肺间质中未见炎症细胞浸润，C组可见大量细胞凋亡，肺组织结构被破坏，肺组织中可见大量炎症细胞浸润，EPC组排斥反应评分和细胞凋亡明显低于C组，炎症细胞在移植肺内的浸润低于C组。因此我们认为与S组比较，C组和EPC组移植肺出现典型的排斥反应病理学改变，包括肺泡、血管周围大量中性粒细胞、T细胞浸润，肺组织严重萎陷、实变，肺组织严重水肿、肺泡断裂。与C组比较，EPC组的排斥反应评分降低（图2）。
3 讨 论
_本研究结果发现，EPC组PaO2/FiO2高于C组，排斥反应评分、肺组织湿/干重比低于C组，表明EPC可以提高移植肺功能，减轻肺移植后的急性排斥反应，减轻移植肺损伤；本研究结果还发现，EPC组与C组比较，受体大鼠外周血中LFA-1、ICAM-1及肺组织中的IFN-γ、IL-2明显减少。众多研究结果显示，移植免疫一旦启动，T细胞在器官移植急性排斥反应中起核心作用，CD4+T细胞在ICAM-1和LFA-1的作用下，向移植肺内趋化、浸润并活化。激活后CD4+T细胞不但直接导致移植肺组织损伤，还能分泌IFN-γ、IL-2，不但能导致炎症反应，还可以激活CD8+T细胞，这说明移植免疫和炎症反应相互联系，相互促进。
所以这些研究结果说明，EPC可以通过减轻肺移植后血管内皮细胞损伤，从而抑制其分泌细胞因子ICAM-1和LFA-1，不但能减少外周血中T细胞向移植肺组织中浸润，还能减少IFN-γ、IL-2的释放，从而直接减轻其对肺组织的损伤。另外本研究还发现，EPC还可以促进IL-10的分泌，IL-10作为一种抑炎因子，不仅能抑制外周血中其他炎症细胞的迁移，还能抑制其他炎症细胞活化；这一结果进一步阐明了EPC可以减轻排斥反应。
我们目前对于EPC对肺移植急性排斥反应的影响仅进行了初步研究，其具体的机制还需要我们进一步研究；另外，由于EPC在免疫方面的研究尚处于早期阶段，有关EPC能否直接抑制淋巴细胞增殖、活化，尚未有定论，需要我们进一步研究。
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