研究方法培训
临床科研方法与论文写作能力提升大师（网络）研讨会（10月4-16日） 年10月4-16日血小板在动脉粥样硬化血栓形成中起关键作用，因此针对稳定及不稳定斑块，抗血小板治疗在减少心梗及卒中风险中卓有成效。既往研究认为血小板激活为心血管血栓事件的前提，其伴随局部凝血系统的激活，最终导致冠脉血栓形成。但这一体内过程的具体机制尚未明晰。
近期研究表明，脂多糖（LPS）通过促进巨噬细胞释放炎症因子，加重氧化应激损伤血管壁进而导致血栓形成。而吸烟及感染患者循环血中的内*素水平也与其动脉粥样硬化的发展息息相关，内*素通过上调巨噬细胞组织因子的表达及与Toll样受体4的相互作用放大血小板激活反应，该情况在无脓*症患者体内仍可检测，但急性冠脉综合症中，内*素与血小板血栓形成的调控关系尚待解析。
对此，来自意大利罗马大学麻醉学与心血管医学系的GaetanoTanzilli和FrancescoVioli教授团队提出假设，认为冠心病患者的轻度内*素血症可促进不稳定斑块的血栓形成。为探索这一问题，团队检测了ST-段抬高性心肌梗死（STEMI）患者与稳定性心绞痛（SA）患者外周血及冠脉血流中血小板激活标志物和LPS浓度并通过体内和体外实验证明LPS可促进血栓形成。该研究结果发表于心血管领域顶级期刊《EuropeanHeartJournal》中，题目为“Low-gradeendotoxaemiaenhancesarterythrombusgrowthviaToll-likereceptor4:implicationformyocardialinfarction”
病例-对照研究
研究首先纳入50名STEMI患者，50名SA患者及50名年龄性别及心血管风险因素匹配的对照组患者，三组患者在年龄，性别，高血压糖尿病病史，高血压及他汀类药物使用方面无统计学差异。STEMI患者及SA患者β受体阻滞剂，抗血小板药物使用更多。STEMI患者白细胞计数、C反应蛋白水平及血清LPS，连蛋白和可溶性P选择素水平高于其他两组。
表1：基线特点
由于吸烟者血清LPS，连蛋白和可溶性P选择素水平高于非吸烟者，因此研究者采用因子方差分析矫正吸烟后发现三组间三种标志物水平差异仍然显著。此外，STEMI患者外周血oxLDL,TF，TNF-α，IL-1β水平更高。每组内血清LPS水平均与连蛋白水平显著相关。
图1：三组患者血清LPS,连蛋白，可溶性P选择蛋白、oxLDL,组织因子、TNF-α、IL-1β、16sDNA水平
图2：三组内血清连蛋白与LPS相关性
在STEMI患者血栓中LPS、可溶性P选择素、组织因子、促炎性细胞因子浓度均高于与SA患者冠脉血中浓度，但oxLDL水平在两组间无差异。
图3：SA与STEMI患者LPS,可溶性P选择蛋白、oxLDL、组织因子、TNF-α、IL-1β水平
为分析连蛋白、内*素血症及血小板激活的相关关系，研究者根据血清连蛋白中位数水平将患者进行分组，连蛋白水平患者在STEMI组占80%，SA组占46%，对照组占22%。而连蛋白水平更高的STEMI患者冠脉血栓中LPS和可溶性P选择素浓度也更高。
最后研究者采用对患者血栓样本进行免疫组织化学分析，发现血栓内中性粒细胞弥漫浸润，所有血栓样本均有组织蛋白酶G表达，80%样本有TLR4有阳性表达，25%的样本有LPS表达。
图4：冠脉血栓的免疫组织化学检测
体外实验
接下来，研究者探索是否冠脉血栓中的低浓度LPS可与TLR4相互作用并在体外激活血小板，因此采集健康受试者外周血分别用病例对照研究中测定浓度的LPS及oxLDL共同孵育，结果表明LPS可促进多核白细胞/血小板聚集，且该效应随LPS浓度增加而增强，并可被TLR4抑制剂及组织蛋白酶G抑制剂阻断。而oxLDL仅在最高浓度时促进多核白细胞/血小板聚集，且该效应不受TLR4抑制剂及组织蛋白酶G抑制剂影响。
图5：LPS促进多核白细胞/血小板聚集
动物模型
最后研究者对行小鼠动脉阻塞手术，予以LPS注射，观察股动脉血流峰值流速改变，发现动脉阻塞后，LPS处理组股动脉峰值流速显著降低，但LPS并不影响未经血管阻塞处理股动脉血流。组织学分析表明，LPS处理组小鼠血管闭塞性血栓形成增多，股动脉官腔阻塞程度增加。而同时使用TLR4抑制剂后，LPS处理组小鼠股动脉血流峰值流速有所恢复。LPS处理组小鼠血清LPS、可溶性P选择素、TNF-α水平升高，注射TLR4抑制剂后，虽然小鼠血清LPS浓度与单独LPS处理组小鼠无差异，但其外周血可溶性P选择素和TNF-α浓度显著降低。
图6：LPS促进小鼠导丝损伤后血管内血栓形成
结论：ST段抬高型心肌梗死患者肠道渗透性增加，脂多糖进入循环血中，最终可促进白细胞-血小板相互作用导致冠脉血栓形成。
文献来源：doi:10./eurheartj/ehz
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