杂志名称：Stemcellresearchtherapy
影响因子：6.83
文献题目：GDF11enhancestherapeuticfunctionsofmesenchymalstemcellsforangiogenesis
第一作者：ChiZhang
通讯作者：HongYu
作者单位：浙江大学医医院
本实验所用产品：AAH-ANG-1-2（20个血管生成相关因子）
实验样品：细胞培养上清
研究背景：
干细胞移植是组织修复和器官再生较有前景的方法。干细胞疗法确保促进缺血组织再生的血管生成。间充质干细胞（MSC）是治疗心血管疾病最常用的细胞之一。然而，干细胞疗法对缺血修复的疗效因细胞保留率低而受到限制。
血管生成由许多细胞因子和生长因子调节。其中，血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子β1（TGF-β1）起重要作用。VEGF和TGF-β1通常在发生血管生成的组织中共同表达，尤其是在各种肿瘤中。
GDF11是TGFβ超级家族的成员，对发育、生理和疾病有多重影响。有研究表明GDF11对骨髓衍生MSC（BM-MSCs）分化成EC样细胞有积极影响，在心脏间充质干细胞中具有保持线粒体形态和功能的作用。然而，GDF11对MSC血管生成影响机制尚未完全阐明。因此，这项研究的目的是研究GDF11是否会影响干细胞移植的疗效，在体外和体内过表达GDF11后，探索了MSC的血管生成潜力。
1结果
1.1GDF11增强MSC在体内的生存
GDF11过表达MSC比对照MSC的存活率更高，凋亡更少。当他们在低血清和缺氧条件下培养时（附加文件1：图6），这证实了先前的结果，GDF11保护MSC免受体外缺氧引起的凋亡。此外，当MSC使用体外重组GDF11进行处理时，观察到GDF11对MSC的类似保护作用图7）。在体内，在MSC被注射到缺血性肌肉后，从荧光素酶和GFP的检测结果发现，GDF11组比空载体组更多地保留在体内。MSC-GDF11注射后7天在荧光素成像下仍然可检测到，而MSCs空载体组几乎看不见（图1A，B），实验证明，GDF11在体外能保护MSCs免受缺氧诱导的凋亡，并促进四肢的血管生成和恢复。
1.2过表达GDF11通过促进血管生成和肌肉再生增强了MSC对后肢缺血的治疗
在股动脉结扎后使用激光多普勒灌注成像(LDPI)测量缺血后肢的再灌注（图2A）。接受MSC-GDF11的小鼠再灌注明显好于对照组（注射PBS或MSCs-Vector）（图2B）。与对照组（MSCs-Vector）相比，MSCs-GDF11的给药也显着增加了术后14天缺血性腓肠肌中再生肌纤维的数量（图2C，D）。通过免疫染色进行分析缺血肌肉中的血管密度（图2E）。在注射后第14天，与接受PBS或MSCs-Vector的小鼠相比，接受MSCs-GDF11的小鼠的毛细血管CD31+（图2F）和小动脉αSMA+（图2G）密度明显更高。在接受预处理的MSCs的缺血肢体肌肉中，促血管生成细胞因子血管内皮生长因子-A(VEGFA)、肝细胞生长因子(HGF)和基质衍生因子-1(SDF-1)的mRNA水平增加。然而，没有观察到MSCs直接分化为ECs。
1.3GDF11增强MSCs的血管生成旁分泌活性
为了了解GDF11增强MSC促血管生成活性的机制的机制，通过使用人血管生成因子抗体芯片C1（图3A）对MSC中与血管生成相关的蛋白质进行了分析。MSC-GDF11条件培养基中的血管生成细胞因子明显多于MSC-vector（图3B），例如表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）、胎盘生长因子（PLGF）。此外，ELISA（图3C）和WB（图3D、E）检测到了增加的VEGF和HGF。
1.4GDF11改善了MSCs对HUVEC的旁分泌作用
研究团队为了确认GDF11对MSC旁分泌的积极影响，使用MSC的条件培养基来处理HUVEC。结果表明更多迁移的HUVEC和血管形成，这表明来自MSC-GDF11的培养基能加速HUVEC的促血管生成功能。为了检查GDF11对EC可能的直接影响，用rGDF11蛋白处理HUVEC。HUVEC的细胞活力、管形成和迁移没有被外部rGDF11显着改变。此外，MSC-GDF11具有比对照MSC-Vector更高的迁移率。
1.5当GDF11被siRNA敲低时，MSCs的功能受损
为了验证GDF11对MSCs的保护作用，通过用siRNA（MSC-GDF11-siRNA和MSCNC-siRNA）转染来敲低MSCs中的GDF11表达。与MSC-NC-siRNA相比，MSC-GDF11-siRNA中的GDF11mRNA（图5A）和蛋白质（图5B）均显着减少。与MSC-NC-siRNA相比，MSC-GDF11-siRNA中GDF11表达降低，凋亡相关蛋白BCL2/BAX（图5B，C）和细胞活力（图5D）也降低。在GDF11敲低后，与MSCNC-siRNA相比，MSCGDF11-siRNA的管形成能力（图5E、F）和迁移（图5G、H）在MSCGDF11-siRNA中显着恶化。与MSCNC-siRNA相比，MSCs促进HUVEC管形成（图5I，J）和迁移（图5K，L）的旁分泌能力在MSCGDF11-siRNA中也显着受损。
1.6GDF11的效果是通过与TGFβ受体结合并激活PI3K/AKT
抗体芯片检测结果和KEGG分析表明，PI3K/AKT信号通路是前20条注释富集通路中GDF11过表达最显着改变的通路之一。因此，为了确定GDF11对MSC影响背后的分子机制，研究了PI3K/AKT信号通路。GDF11组与MSC对照组相比，PI3K和AKT的磷化显著增加（图6B，C），而与MSCNC-siRNA相比，在MSCGDF11-siRNA中检测到PI3K和AKT的磷酸化显着降低（图6D，E）。当添加PI3K抑制剂LY阻断AKT的磷化时，GDF11对MSC的保护作用就减弱了。MSC-GDF11组中较高的VEGF表达也被LY阻断（图7E），表明GDF11介导的促血管生成作用部分依赖于Akt。MSC-GDF11培养基增强的HUVEC管形成也被LY阻断（图7F，G）。这些结果表明PI3K/AKT信号通路对于GDF11诱导的MSC抗细胞凋亡和促血管生成功能的增强是必不可少的。
结论：
在该研究中，GDF11能提高MSC的存活率，增加促血管生成因子的分泌，增强MSC的治疗潜力，并促进缺血组织的血管生成。通过使用人类血管生成芯片（AAH-ANG-1-2）在对MSC中与血管生成相关的蛋白质进行分析时，结果展示了GDF11在促进MSC治疗缺血性疾病方面的重要作用且主要机制与PI3K/AKT信号通路相关，可用于制定缺血性心血管疾病的新治疗策略。干细胞疗法对缺血修复的疗效因细胞保留率低而受到限制。迫切需要改善干细胞治疗的战略。GDF11的治疗有可能应用于缺血性血管疾病的糖尿病患者。